Dosage de l’ATP

 

Sommaire

1. Principes et bases techniques du dosage d'ATP

Go !

       A. Principe et avantages du dosage d'ATP par la bioluminescence

Go !

       B. Appareils et techniques de mesure

Go !

                a. Le Luminomètre

Go !

                b. Limites de la méthode et conditions expérimentales requises

Go !

                c. Correction et expression des résultats

Go !
   

2. Applications Analytiques

Go !

       A. Mesure de l'ATP des micro-organismes

Go !

                a. Obtention d'un ATP mesurable

Go !

                b. Résultats

Go !

                c. Applications

Go !

       B. Mesure de l'ATP des cellules d'organismes pluricellulaires

Go !

                a. Obtention d'un ATP mesurable

Go !

                b. Résultats

Go !

                c. Applications

Go !

 

bioluminescence@free.fr


 

1.  Principe et bases techniques du dosage d'ATP

18_3.gif (1678 octets)



       A.  Principe et avantages du dosage d'ATP par la bioluminescence

 

      L'ATP ou Adénosine Tri-Phosphate est un intermédiaire énergétique majeur et obligatoire de très nombreuses réactions du métabolisme cellulaire. C'est la rupture des liaisons entre les différents groupes phosphate qui est responsable de la libération d'énergie.

      Toute cellule vivante produit et consomme de l'ATP. Ce coenzyme est donc spécifique des milieux vivants, et on va considérer que toute trace d'ATP est le témoin d'une trace de vie (cellules vivantes ou ayant vécu, car l'ATP n'est pas détruit en totalité à la mort de la cellule). On peut donc dès maintenant entrevoir l'utilité et l'importance du dosage de l'ATP : détection d'une contamination bactérienne, études de mécanismes et de réactions physiologiques où il intervient, etc., et en fait, depuis sa découverte en 1929, on a très vite cherché à le doser en regard de son importance fonctionnelle et quantitative. Il existe plusieurs méthodes de dosage, dont celles mettant en jeu des réactions de luminescence.

      Pour effectuer ce type de dosage, on va mesurer la lumière émise par la réaction enzymatique de bioluminescence utilisant la luciférine et la luciférase de luciole, ainsi que de l'ATP bien entendu. L'ATP intervient dans l'étape d'activation du complexe luciférase-luciférine, dont l'oxydation est à l'origine d'une émission lumineuse.

      On a pu tracer la courbe cinétique de la réaction luciférine-luciférase, et on observe qu'elle est composée de trois phases principales : un temps de latence, une phase de croissance et une phase de décroissance de l'intensité lumineuse.

      La concentration de l'ATP influe sur les phases de croissance et de décroissance de la courbe de cinétique, et il est essentiel de noter, en particulier, que l'intensité lumineuse I max varie proportionnellement à la quantité d'ATP présent dans le milieu. Le dosage de l'ATP repose donc sur la mesure de l'intensité de l'émission lumineuse qui se produit dans un milieu mis en présence de luciférine et de luciférase de luciole.

      Que ce soit en bioluminescence ou en chimioluminescence, la mesure de la lumière émise par une réaction chimique est pratique à cause de cette relation de proportionnalité directe qui existe entre le quantum de lumière émise et la quantité de réactif limitant. On fera en sorte que l'ATP soit le réactif limitant dans toutes les expériences de dosage d'ATP.

      La luminométrie (technique de mesure de la lumière émise par une réaction) possède plusieurs avantages par rapport aux autres techniques, plus conventionnelles (fluorimétrie et spectrophotométrie) car elle concilie :

      - une sensibilité extraordinaire ;

      - des instruments de mesure et des réactifs très peu chers ;

      - un protocole expérimental très simple ;

      - un bruit de fond très réduit ou nul.

En effet, la luminométrie est environ 100 000 fois plus sensible que la spectroscopie d'absorption et 1000 fois plus que la fluorimétrie. En fait, un luminomètre (c'est l'appareil de mesure) bien réglé peut détecter jusqu'à 0,6 picogrammes d'ATP ou 0,1 femtogrammes de luciférase.

      Lors des réactions de luminescence, il y a deux composantes dans la lumière qui atteint le détecteur. La première composante est proportionnelle à la concentration en réactif limitant de la réaction, et la deuxième composante a une valeur à peu près constante : c'est le "bruit de fond". Cette lumière résiduelle est due à de nombreux facteurs comme la phosphorescence des plastiques, la présence d'impuretés dans les réactifs, etc. Il faut savoir que ce "bruit de fond" est beaucoup plus faible en luminométrie qu'en spectrophotométrie ou fluorimétrie.

18_3.gif (1678 octets)

 

       B.   Appareils et techniques de mesure

 

      Ils vont varier en fonction du type de mesure (but de la mesure : analyse de routine ou recherche métabolique) et des résultats attendus (précision, sensibilité, rapidité d’exécution), mais aussi en fonction de l'échantillon (pureté, stabilité du milieu,...).

18_3.gif (1678 octets)

 

                a. Le luminomètre

 

      Le luminomètre est le moyen le plus pratique et le plus sensible de quantifier l'émission lumineuse dégagée par la réaction luciférine-luciférase. La lumière, telle que nous la voyons, est constituée par des millions de petites entités d’énergie appelées photons. Ce sont ces photons émis par la réaction bioluminescente, qui vont être comptés par le luminomètre. Il existe plusieurs modèles de luminomètres, de prix, design et fonctionnement variables. Néanmoins, tous ont en commun une chambre à échantillon, un détecteur, un processeur qui traite le signal reçu et une sortie permettant de lire les résultats.

      La chambre à échantillon du luminomètre, qui contient le tube de test, présente l'échantillon luminescent au détecteur. La chambre doit être isolée de la lumière ambiante afin de minimiser les interférences potentielles. Elle devrait être positionnée aussi près que possible du détecteur pour obtenir une efficacité optique optimale.

      En ce qui concerne les détecteurs, les photodiodes et les tubes photomultiplicateurs sont les composants que l'on trouve le plus communément dans les luminomètres commerciaux bon marché. Les améliorations qui ont été apportées aux photodiodes leur ont permis d'atteindre un niveau satisfaisant de sensibilité, mais les photomultiplicateurs restent néanmoins les détecteurs les plus puissants et les plus utilisés pour la détection d'émissions lumineuses extrêmement faibles. Le fonctionnement des photomultiplicateurs consiste à amplifier le passage d'un photon en une cascade d'électrons. Cette amplification est très rapide et libre de toute influence électrique extérieure. C'est cette réponse rapide du photomultiplicateur qui fait tout l'intérêt de la mesure de la bioluminescence.

 

      Deux paramètres peuvent être utilisés pour la mesure d'une concentration en ATP, et ce suivant les appareils :

          - La mesure de I max : C'est la plus utilisée car la proportionnalité entre I max et la quantité d'ATP est assez rigoureuse, et de plus les appareils mis en jeu sont assez simples. Ils doivent néanmoins être très sensibles, étant donné la faiblesse des émissions lumineuses mises en jeu ;

          - L'intégration du flux lumineux sur un temps donné : elle permet d'utiliser des appareils un peu moins sensibles, mais la proportionnalité entre la concentration en ATP et la lumière émise sur un temps donné est moins stricte, surtout en fin de réaction.

      La plupart des luminomètres actuels sont soit des compteurs de photons au sens strict utilisant un photomultiplicateur, soit des appareils de mesure courante qui évalue le courant électrique résultant du choc des photons sur le photomultiplicateur. Comme tous les photons ne sont pas dirigés vers le photomultiplicateur, aucun des deux types de luminomètre n'est à même de détecter tous les photons émis lors de la réaction chimique. Néanmoins, les résultats obtenus sont très bons avec l'un ou l'autre des deux types d'appareils. Le seul inconvénient concernant les compteurs de photons est l'intensité lumineuse maximale mesurable qui atteint des valeurs relativement (voire un peu trop) basses.

18_3.gif (1678 octets)

 

                b. Limites de la méthode et conditions expérimentales requises

      La mesure de l'émission lumineuse est subordonnée à quelques impératifs techniques avec lesquels il faut savoir jongler pour obtenir des mesures exploitables.

      Tout d'abord, il faut savoir que la luminescence est très sensible aux composants du milieu. Lors de l'étalonnage du luminomètre avec une solution titrée, il faut veiller à bien utiliser des dilutions d'ATP et des réactifs qui se rapprochent le plus possible de la composition réelle de l’échantillon que l'on voudra doser. Les concentrations ont une importance capitale. En effet, la lumière émise est directement proportionnelle au volume de l'échantillon lorsque les concentrations et les proportions sont respectées, mais il a été démontré qu'une quantité donnée du mélange ATP/luciférine/luciférase dégage plus de lumière que deux fois cette quantité diluée de moitié, même si la même quantité de réactif est mesurée dans chaque cas.

      Les manipulations du luminomètre sont également sujettes à caution, et notamment les modalités de mélange des réactifs. Afin d'obtenir des mesures précises de luminescence, il est nécessaire d'injecter les réactifs et de les mélanger à l'échantillon un grand nombre de fois. On peut choisir une injection manuelle ou un système d'auto-injection disponible sur la plupart des luminomètres du commerce. L'injection automatique est généralement utilisée pour réaliser des réactions "éclair" extrêmement rapides. En effet, comme la cuvette contenant l'échantillon se trouve déjà dans la chambre, l'important dégagement initial de lumière peut être détecté, et la synchronisation entre le timing de l'injection des réactifs et la production lumineuse peut être respectée. En revanche, dans certaines expériences, le niveau lumineux augmente petit à petit, et il est d'abord nécessaire de pré-tester au moins un échantillon pour déterminer le temps nécessaire à l'obtention de la valeur la plus grande de l'intensité lumineuse. Dans ces cas-là, l'injection manuelle peut être préférée pour des raisons de simplicité et de coût. Néanmoins, l'injection automatique permet d'éviter les erreurs de manipulation car elle est indépendante de la technique de l'opérateur. De plus, les échantillons peuvent être analysés plus rapidement.

 

 

      Enfin les conditions physiques du milieu ont aussi un rôle à jouer. Il faut vérifier que le milieu ne contient pas d'impuretés et n'est pas contaminé par de l'ATP microbien étranger à l'échantillon (risque de faux positif). De la même manière, la présence de conservateurs peut entraîner la constatation de faux négatif. La réaction est également très sensible à la présence de nucléotides phosphates comme l'ADP qui interfère par la production d'ATP selon la réaction :

ADP + ADP ----->  ATP + AMP

si l'enzyme (Adénylate kinase) est présente dans le milieu.

Le GTP modifie également la courbe de décroissance après le pic lumineux, par formation d'ATP :

ADP + NTP (GTP par ex.) ------> ATP + NDP

 

Emission lumineuse relative

temps (s)

% de GTP rajouté dans chaque cas (de gauche à droite et sachant que le taux d'ATP est constant): 0; 20; 40; 60; 80; 100.

 

      Quoi qu’il en soit, il en résulte que le luminomètre enregistre dans les deux cas un faux positif.

      Il faut aussi tenir compte de la stabilité de l'ATP qui est différente selon les conditions de milieu (pH, température, et bien sûr concentrations). En effet, l'ATP peut se conserver pendant plusieurs mois en solution à -18°C, seulement quelques heures dans la glace, et à température ambiante, l'hydrolyse est très rapide. La température affecte aussi la vitesse de réaction, selon les lois thermodynamiques. La température optimale se situe bien en dessous de la température ambiante, et aux alentours de 30°C, les réactifs se détériorent très rapidement. Il faut aussi noter que les réactifs doivent être à des températures similaires lors du mélange, afin de respecter au maximum les mécanismes de la réaction.

18_3.gif (1678 octets)

 

                c. Corrections et expression des résultats

      La mesure obtenue et lue sur le luminomètre doit être corrigée, et notamment du bruit de fond. Il est donc nécessaire d'établir des blancs, et le résultat de la mesure d'ATP dans l'échantillon est corrigée en lui soustrayant simplement la valeur obtenue pour le blanc.

18_3.gif (1678 octets)

 


 

2. Applications analytiques

 

       A. Mesure de l'ATP des micro-organismes

      Comme toute forme de vie contient de l'ATP, les applications en microbiologie sont basées sur le prélèvement des micro-organismes, la lyse de ces cellules et la mesure de la quantité de lumière émise par le milieu contenant à l'origine la luciférine et l'enzyme luciférase.

18_3.gif (1678 octets)

 

                a. Obtention d'un ATP mesurable

      La détection des micro-organismes par la méthode luciférine-luciférase requiert l'action d'un agent d'extraction pour lyser les cellules et déverser le contenu cellulaire dans le milieu à analyser. Etant donné la très grande diversité des micro-organismes (bactéries, protozoaires, algues, levures), la présence ou non de paroi plus ou moins épaisse, et la grande variété des milieux dans lesquels ils se trouvent, l'extraction de leur ATP constitue l'étape la plus difficile du protocole de mesure. Les principales méthodes d'extraction font intervenir des agents chimiques (solvants organiques, acides, tampons) ou physiques (ultrasons, chaleur). Le tableau présente quelques exemples de méthodes d'extraction de l'ATP dans des cultures bactériennes.

 

Méthode d’extraction

Composition du milieu d’extraction

Température

(°C)

% d’inhibition

DMSO Diméthylsulfoxyde

0,9 mL DMSO

13,9 mol/L

+20

51

APC (HClO4)

Acide perchlorique

1 mL APC

1,2 mol/L

0

69

H2SO4

Acide sulfurique

1 mL H2SO4

0,6 mol/L

0

82

Ethanol

5 mL éthanol à 96 %

+78

22

Ultrasons

-

+20 à +60

23

 

      La plupart des agents chimiques présentés ci-dessus sont des inhibiteurs de la réaction de bioluminescence (voir tableau ci-dessus). L'inhibition peut être forte, et c'est souvent le cas, excepté dans les méthodes où l'agent d'extraction est éliminé avant la mesure (éthanol) ou qui ne comportent pas d'agents inhibiteurs (ultrasons). De plus, dans le cas de l'utilisation de l'acide perchlorique, une partie de l'ATP est adsorbée par le précipité et disparaît avec lui.

      Le milieu d'origine des micro-organismes a aussi son importance, notamment pour les sols, dont la composition va modifier l'efficacité des facteurs d'extraction. Il est conseillé de faire des essais préalables et d’utiliser des réactifs acides qui neutralisent une bonne part des réactions parasites. Il faut également faire attention à ce que le milieu ne soit pas contaminé par de l'ATP d'un autre micro-organisme.

      Enfin, malgré tous ces facteurs, il faut savoir qu'à la base, les différentes méthodes n'ont pas la même efficacité selon les souches de bactéries. Exemple : H2SO4 est très efficace sur Streptococcus aureus, mais très peu satisfaisant sur Escherichia coli.

18_3.gif (1678 octets)

 

                b. Résultats

      Les quantités d'ATP mesurées par bioluminescence sont très proches de celles mesurées par des méthodes conventionnelles, plus longues, laborieuses et coûteuses. Si des résultats sont variables, et souvent au sein d'une même espèce, ces variations sont souvent dues à la difficulté de détermination du nombre exact de micro-organismes dans le milieu de prélèvement, mais aussi au fait que les taux d'ATP cellulaire peuvent varier de façon importante selon les conditions physiologiques des micro-organismes.

 

Espèce

Taux d’ATP par cellule

Causes de la variation

BACTERIES

Bacillus cereus

 

0,11 fg

12 à 103,6 fg

-

Croissance

Proteus vulgaris

0,18 fg

-

Streptococcus fecalis

0,5 à 6,93 fg

Croissance

Staphylococcus epidermis

0,82 fg

-

LEVURES

Saccharomyces cerevisiae

28 fg

-

ALGUES

Chlorella pyrenoida

50 fg

-

PROTOZOAIRES

Plasmodium berghei

0,3 à 1,02 fg

Milieu

 

      Les résultats divergeants du tableau ne sont donc pas incompatibles. En fait, il apparaît que la conversion d'une quantité d'ATP en nombre de micro-organismes n’est réalisable qu’en présence d’une seule espèce, dans des conditions physiologiques précises. Néanmoins, la valeur moyenne de la teneur en ATP par cellule chez les bactéries, par exemple, oscille entre 0,1 et 0,5 fg.

      La précision des mesures d’ATP après les différentes méthodes d’extraction est de l’ordre de 5 à 10 %.

18_3.gif (1678 octets)

 

                c. Applications

      La connaissance du taux d’ATP cellulaire et la suivie de son évolution en temps réel a permis aux microbiologistes et biochimistes d’étudier plus en détails certaines voies métaboliques cellulaires (et bactériennes notamment) qui restaient mal connues. On a également pu étudier la biologie de certains agents pathogènes. Par exemple, une meilleure connaissance du métabolisme du protozoaire Plasmodium berghei a été nécessaire pour d’améliorer la chimiothérapie du paludisme.

      L’autre grande application du dosage d’ATP est la détection de cellules dans un milieu donné, et ce avec deux objectifs :

            - Détermination d’une contamination bactérienne : Le dosage d’ATP par la méthode luciférine-luciférase caractérise la présence ou l’absence de micro-organismes. Tous types d’industriels font appel à cette méthode pour dépister une éventuelle contamination bactérienne. En effet, beaucoup de méthodes rapides de microbiologie ne conviennent pas lorsqu’on les applique aux cosmétiques, ou autres produits de soin, à cause des interférences possibles avec un ou plusieurs des constituants du produit, de la complexité de la procédure, d’une sensibilité inadéquate, ou même de difficultés à détecter certains types de micro-organismes. L’utilisation de la biolumunescence s’est alors logiquement imposée car cette technique ne présente pas tous ces inconvénients. De plus elle commence à démontrer aux Etats-Unis qu’elle est à la base de bénéfices réels pour les entreprises qui l’utilisent. La bioluminescence est également utilisée dans l’industrie alimentaire pour la raison majeure que c’est une méthode instantanée ou presque, et que les denrées alimentaires, comme la viande par exemple, ne peuvent pas attendreles délais nécessaires aux autres méthodes (immersion d’un bout de viande dans un milieu nutritif et attente de quelque jours pour distinguer d’éventuelles colonies bactériennes signant une contamination de la viande d’origine).

            - Détection de biomasse : L’ATP étant le témoin privilégié de toute forme de vie, on a beaucoup utilisé la méthode luciférine-luciférase pour étudier la biomasse des fonds marins ou de certains lacs. Elle est utilisée également pour la détection des polluants biologiques des eaux douces ou des polluants chimiques, surtout par les métaux lourds. Elle peut également par exemple permetre une appréciation sur l’activité de certains désinfectants (chlore sur les eaux usées).

      Enfin, des détecteurs électroniques spéciaux, utiisant la bioluminescence, ont été placés dans des sondes spatiales pour traquer la présence de formes de vie dans l’espace.

18_3.gif (1678 octets)

 

       B. Mesure de l’ATP des cellules d’organismes pluricellulaires

                a. Obtention d’un ATP mesurable

      A la différence des micro-organismes, l’étape la plus délicate en vue d’obtenir un ATP mesurable est celle du prélèvement et des divers traitements précédant l’extraction de l’ATP des tissus.

      Dès la mort de l’animal, les nucléotides phosphates s’hydrolysent rapidement sous l’action de l’ATPase. Il est préférable de sacrifier les animaux de laboratoire (rat ou souris) sous anesthésie, pour éviter une trop grande perte d’ATP, perte pouvant aller jusqu’à 100%. Chez l’homme, l’anesthésie est recommandée. Pour arrêter l’action des enzymes modifiant les taux de métabolites après la mort cellulaire, l’utilisation du froid est la plus fréquente et permet d’obtenir de bons résultats. Néanmoins, le délai doit être minimum entre le prélèvement et le refroidissement des cellules de l’échantillon. La méthode luciférase-luciférine autorise un échantillonnage de très faible taille et permet donc un refroidissement plus rapide de l’échantillon

      Certaines méthodes ne font pas intervenir le froid, mais diverses incubations dans des milieux physiologiques. Les micro-ondes sont également utilisées aves succès.

      En ce qui concerne le sang, il faut garder les cellules à l’abri de la lumière afin qu’elles se conservent, et à température ordinaire. La durée de vie de l’ATP est tout de même très faible puisqu’elle est de 40 min au maximum. Elle est encore plus courte si on centrifuge en vue d’une séparation des érythrocytes. Néanmoins, les difficultés rencontrées au niveau du prélèvement des tissus animaux ne se retrouvent pas en ce qui concerne le prélèvement des cellules sanguines, puisqu’elles ont une vie autonome.

      L’extraction de l’ATP se fait en général à partir des cellules conservées dans l’azote liquide, mais elle peut aussi avoir lieu dans le milieu de cuilture ou le plus rapidement possible après le prélèvement. Les méthodes sont comparables à celles utilisées pour les micro-organismes, mais l’acide perchlorique (ACP) est de loin le plus utilisé. Toutes les méthods ont à peu près la même efficacité, étant donné que les cellules ne sont pas protégées par une paroi comme c’est le cas chez les bactéries. L’ACP possède néanmoins un inconvénient : il n’inhibe pas assez vite les ATPases. Il faut lui associer de l’EDTA qui intervient sur les ions métallliques cofacteurs de l’action ATPasique. Ce défaut est également observé avec l’éthanol notamment.

      La sensibilité de la méthode luciférine-luciférase permet de mesurer l’ATP d’une cellule isolée. Il peut s’agir d’une hématie, dont l’ATP sera extrait sélectivement par un faisceau laser focalisé par un objectif de microscope. L’ATP est libéré dans le milieu contenant la luciférine et la luciférase. Il peut s’agir aussi d’une autre cellule (macrophage,…) qui sera isolée dans un capillaire et subira alors l’extraction. Néanmoins, le rayon laser ne doit pas être trop puissant pour ne pas endommager la luciférase. La sensibilité obtenue est 20 fois supérieure aux autres méthodes.

18_3.gif (1678 octets)

 

                 b. Résultats

      Les tissus animaux prélevés in vivo ont un tauxd’ATP de l’ordre de la mmol par gramme de tissu frais.Le taux d’ATP des tissus végétaux est de l’ordre de la nmol. Pour un même type de tissu, les variations dues à l’espèce sont faibles, mais les conditions physiologiques de la cellule interviennent pour un tissu donné.

 

Conditions physiologiques

Taux d’ATP

Cellule musculaire :

au repos

en activité

 

1 mmol

10 mmol

Cellule cancéreuse

10-2 à 3 mmol

Cycle cellulaire

Multiplié par deux

 

      Enfin, il faut rappeler que la sensibilité de la méthode permet d’effectuer des prélèvements de l’ordre du milligramme ou du microgramme, ce qui permet, comme dens le cas de prélèvement de tissu myocardique par exemple, de ne pas entraîner de désordres physiologiques trop importants.

18_3.gif (1678 octets)

 

               c. Applications

      La bioluminescence a permis l’étude de nombreux mécanismes physiologiques comme ceux du cycle cellulaire, de la syntèse et de la dégradation des protéines, de l’ARN, de l’ATP et des phospholipides, de la conduction nerveuse, de l’agrégation plaquettaire, etc.

      Elle a également des applications en pathologie, au niveau de la recherche fondamentale sur la physiologie des cellules cancéreuses par exemple, mais aussi des infections virales. Elle permet le dépistage et le diagnostic de maladies comme la myopathie de Duchenne, ou le syndrome d’hyperthermie maligne des porcins, ainsi que certaines affections aiguës du myocarde ou cérébrales.

      Enfin, au niveau chirurgical, elle permet notamment une connaissssance rapide de l’état métabolique des cellules du myocarde ou de diverses cellules de l’organisme lors d’une intervention chirurgicale.

 

bioluminescence@free.fr

18_3.gif (1678 octets)